РЕЗЮМЕ. Проведена генетическая трансформация инбредных линий и гибридов F1 кукурузы, зарегистрированных в Украине. В исследовании был использован биолистический метод генетической трансформации незрелых зародышей кукурузы, которые образовывали каллусную ткань, и вектор pAHC25, который содержал гены фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы (bar) и β-глюкуронидазы (uidA). В результате трансформации каллусной ткани генотипов кукурузы получены устойчивые к фосфинотрицину каллусные линии и растения-регенеранты. Выявлена активность β-глюкуронидазы в каллусах, устойчивых к гербициду, и методом ПЦР показано присутствие гена bar в ДНК каллусов. Частота стабильной трансформации составляла от 2,2 до 30 % в зависимости от генотипа. Наблюдали взаимосвязь результатов транзиентной экспрессии гена β-глюкуронидазы и стабильной генетической трансформации. Предложенный протокол генетической трансформации кукурузы с использованием исследования транзиентной экспрессии гена β-глюкуронидазы позволяет значительно упростить процесс отбора генотипов, компетентных к генетической трансформации, и создавать трансгенные организмы с новыми признаками.
Проведено генетичну трансформацію інбредних ліній та гібридів F1 кукурудзи, зареєстрованих в Україні. В дослідженні було використано біолістичний метод генетичної трансформації незрілих зародків кукурудзи, що утворювали калюсну тканину, та вектор pAHC25, який містив гени фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази (bar) і β-глюкуронідази (uidA). В результаті трансформації калюсної тканини генотипів кукурудзи отримано стійкі до фосфінотрицину калюсні лінії та рослини-регенеранти. Виявлено активність β-глюкуронідази в калюсах, стійких до гербіциду, та методом ПЛР показано присутність гена bar в ДНК калюсів. Частота стабільної трансформації складала від 2,2 до 30 % залежно від генотипу. Спостерігали взаємозв’язок результатів транзієнтної експресії гена β-глюкуронідази та стабільної генетичної трансформації. Запропонований протокол генетичної трансформації кукурудзи з використанням дослідження транзієнтної експресії гена β-глю-куронідази дозволяє значно спростити процес відбору генотипів, компетентних до генетичної трансформації, та створювати трансгенні організми з новими ознаками.
Ключові слова: Zea mays L., immature embryos, biolistic genetic transformation, bar, uidA
Zea mays L., незрелые зародыши, биолистическая генетическая трансформация, bar, uidA
Zea mays L., незрілі зародки, біолістична генетична трансформація, bar, uidA
Повний текст та додаткові матеріали
У вільному доступі: PDFЦитована література
1. Ji, Q., Xu, X., and Wang, K., Genetic transformation of major cereal crops, Int. J. Dev. Biol., 2013, vol. 57, pp. 495–508. https://doi.org/10.1387/ijdb.130244kw
2. Lu, A., Diehn, S., and Cigan, M., Maize protein expression, in Recent Advancements in Gene Expression and Enabling Technologies in Crop Plants, Azhakanandam, K., et al., Eds., Springer Science+Business Media, LLC, 2015, pp. 3–40. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2202-4_1
3. Anami, S., Njuguna, E., Coussens, G., Aesaert, S., and Van Lijsebettens, M., Higher plant trans-formation: principles and molecular tools, Int. J. Dev. Biol., 2013, vol. 57, pp. 483–494. https://doi.org/10.1387/ijdb.130232mv
4. Sidorov, V.A., Plant tissue culture in biotechnology: recent advances in transformation through somatic embryogenesis, Biotechnol. Acta, 2013, vol. 6, no. 4, pp. 118–131. https://doi.org/10.15407/biotech6.04.118
5. Jefferson, R.A., Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system, Plant Mol. Biol. Rep., 1987, vol. 5, pp. 387–405. https://doi.org/10.1007/BF02667740
6. Christensen, A.H. and Quail, P.H., Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants, Transgen. Res., 1996, vol. 5, pp. 213–218. https://doi.org/10.1007/BF01969712
7. Derkach, K.V., Abraimova, O.E., and Satarova, T.M., Morphogenesis in vitro in maize inbred lines from the Lancaster heterotic group, Cytol. Genet., 2017, vol. 51, no. 1, pp. 48–53. https://doi.org/10.3103/S00-95452717010030
8. Finer, J.J., Vain, P., Jones, M.W., and McMullen, M.D., Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells, Plant Cell Rep., 1992, vol. 11, pp. 323–328. https://doi.org/10.1007/BF00233358
9. Nitovska, I.O., Duplij, V.P., Rudas, V.A., Abraimova, O.E., Satarova, T.M., and Morgun, B.V., Optimization of the conditions of transformation of maize callus tissues by the detection of transient expression of gene of β-glucuronidase.Ach. Probl. Genet. Breed. Biotechnol., 2012, vol. 4, pp. 587–592. ISBN 978-966-171-543-0
10. Murashige, T. and Skoog, F., A revised media for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture, Physiol. Planta, 1962, vol. 15, pp. 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
11. Somma, M., Extraction and purification of DNA. Session 4, in Training Course on the Analysis of Food Samples for the Presence of Genetically Modified Organisms—User Manual, Querci, M., Jermini, M., and Van den Eede, G., Eds., Luxembourg: European Commission, DG Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, 2006. ISBN 92-79-02242-3.
12. Nitovska, I.O., Abraimova, O.Ye., Satarova, T.M., Shakhovsky, A.M., and Morgun, B.V., Biolistic transformation of immature maize embryos, Fakt. Eksp. Evol. Org., Kyiv, 2014, vol. 15, pp. 112–117. ISSN 2219-3782. http://utgis.org.ua/journals/index.php/Faktory/article/ view/313.
13. McDonald, J.H., Handbook of Biological Statistics, Maryland, Baltimore: Sparky House Publishing, 2014, 3rd ed. http://www.biostathandbook.com/
14. Gordon-Kamm, W.J., Spencer, M., Mangano, M.L., Adams, T.R., Daines, R.J., Start, W.G., O’Brien, J.V., Chambers, S.A., Adams, W.R., Jr., Willetts, N.G., Rice, T.B., Mackey, C.J., Krueger, R.W., Kausch, A.P., and Lemaux, P.G., Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants, Plant Cell, 1990, vol. 2, pp. 603–18. https://doi.org/10.1105/tpc.2.7.603
15. McElroy, D., Blowers, A., Jenes, B., and Wu, R., Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act 1) 5' region for use in monocot transformation, Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 231, pp. 150–160. https://doi.org/10.1007/BF00293832
16. Ishida, Y., Saito, H., Ohta, S., Hiei, Y., Komari, T., and Kumashiro, T., High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens,Nat. Biotechnol., 1996, vol. 14, pp. 745–750. https://doi.org/10.1038/nbt0696-745
17. Shou, H., Frame, B.R., Whitham, S.A., and Wang, K., Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated transformation, Mol. Breed, 2004, vol. 13, pp. 201–208. https://doi.org/10.1023/B:MOLB.0000018767.64586.53
18. Brettschneider, R., Becker, D., and Lorz, H., Efficient transformation of scutellar tissue of immature maize embryos, Theor. Appl. Genet., 1997, vol. 94, nos. 6–7, pp. 737–748. https://doi.org/10.1007/s001220050473
19. Ower, R.A., Matheka, J.M., Ali, A.I.M., and Machuka, J., Transformation of tropical maize with the NPK1 gene for drought tolerance, Int. J. Genet. Eng., 2013, vol. 3, no. 2, pp. 7–14. https://doi.org/10.5923/j.ijge.20130302.01
20. Abraimova, O.E., Piralov, G.R., and Satarova, T.M., Biotechnological characteristics of callusogenesis in maize immature embryo culture under the influence of abscisic acid and 6-benzylaminopurine, Visn. Dnipropetrovsk Univ., Ser.: Biol. Med., 2010, vol. 1, no. 1, pp. 3–8. https://doi.org/10.15421/021001
21. Abraimova, O.Ye., Nitovska, I.O., Morgun, B.V., Dzhiubetsky, B.V., Cherchel, V.Yu., Derkach, K.V., and Satarova, T.M., Method of transformation and selection of maize, Patent of Ukraine for Invention no. 117974, 2018, Bull. no. 20.
22. Kennedy, M.M., Stark, H.C., and Dube, N., Biolistic-mediated transformation protocols for maize and pearl millet using pre-cultured immature zygotic embryos and embryogenic tissue, Methods Mol. Biol., 2011, vol. 710, pp. 343–354. https://doi.org/10.1007/978-1-61737-988-8_23
23. Armstrong, C.L., Parker, G.B., Pershing, J.C., Brown, S.M., Sanders, P.R., Duncan, D.R., Stone, T., Dean, D.A., De Boer, D.L., Hart, J., Howe, A.R., Morrish, F.M., Pleau, M.E., Petersen, W.L., Reich, B.J., Rodriguez, R., Santino, C.G., Sato, S.J., Schuler, W., Sims, S.R., Stehling, S., Tarochione, L.J., and Fromm, M.E., Field evaluation of European corn border control in progeny of 173 transgenic corn events expressing an insecticidal protein from Bacillus thuringiensis,Crop Sci., 1995, vol. 35, no. 2, pp. 550–57. https://doi.org/10.2135/cropsci1995.0011183X003500020045x
24. Frame, B.R., Main, M., Schick, R., and Wang, K., Genetic transformation using maize immature zygotic embryos, Methods Mol. Biol., 2011, vol. 710, pp. 327–341. https://doi.org/10.1007/978-1-61737-988-8_22
25. Wang, K. and Frame, B., Biolistic gun-mediated maize genetic transformation, Methods Mol. Biol., 2009, vol. 526, pp. 29–45. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-494-0_3
26. Armstrong, C.L., Romero-Severson, J., and Hodges, T.K., Improved tissue culture response of an elite maize inbred through backcross breeding, and identification of chromosomal regions important for regeneration by RFLP analysis, Theor. Appl. Genet., 1992, vol. 84, nos. 5–6, pp. 755–762. https://doi.org/10.1007/BF00224181
27. Prigge, V. and Melchinger, A.F., Production of haploids and doubled haploids in maize, Methods Mol. Biol., 2012, vol. 877, pp. 161–172. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-818-4_13
28. Satarova, T.N., Cherchel, V.Yu., and Cherenkov, A.V., Kukuruza: biotehnologicheskie i selekcionnye aspekty gaploidii (Maize: Biotechnological and Breeding Aspects of Haploidy), Dnepropetrovsk: Novaya Ideologiya, 2013.
29. Yan, G., Liu, H., Wang, H., Lu, Z., Wang, Y., Mullan, D., Hamblin, J., and Liu, C., Accelerated generation of selfed pure line plants for gene identification and crop breeding, Front. Plant Sci., 2017, vol. 8, no. 1786. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01786