Головна Контакти Архів   Тематика журналу Підписка До уваги авторів Редколегія Дестопна версія

Optimisation of total RNA extraction from bovine oocytes and embryos for gene expression studies and effects of cryoprotectants on total RNA extraction

Pavani K.C., Baron E.E., Faheem M., Chaveiro A., Moreira Da Silva F.

Оригінальна работа 

РЕЗЮМЕ. Экспрессия генов необходима для понимания мейотического созревания ооцитов коровы и возможностей развития эмбриона. В настоящей работе создан стандартизованный протокол экстракции общей РНК ооцитов и зародышей, который рассматривается как
специфичный и менее затратный. Для этой цели ооциты (n = 795), полученные из примерно 80 яичников, были разделены на три группы: группа 1 протокол с модифицированным тризолом® (MTP, n = 355); группа 2 протокол с гуанидин тиоцианатом (GNTC, n = 140) и группа 3 протокол с коммерческим китом (CKP, n = 60). Ооциты из групп 1 (n = 100) и 3 (n = 20) витрифицированы с помощью двух криопротекторов – 1,2-пропандиола (PROH) или диметилсульфоксида (DMSO). 240 оставшихся ооцитов были разделены на три группы, из которых 100 использованы свежими для оплодотворения in vitro, а 140 витрифицированы с помощью PROH (n = 70) и DMSO (n = 70) как криопротекторов, а после оттаивания оплодотворены in vitro. Зародыши использовали через 9 дней после оплодотворения. Амплификация генов (SDHA, GAPDH and DNMT1) проведена в ооцитах, а количественный анализ экспрессии генов (DNMT1) в полученных in vitro зародышах – на стадии бластоцистов (n ≈ 10). Сравнивалась эффективность экстракции. Чистота образцов в разных протоколах колебалась от 1,10 до 1,25 для GNTC; от 2,05 до 2,63 для CKP; от 1,50 до 2,11 для разработанного MTP. В последнем случае значение показателя приближалось к ожидаемому уровню чистоты образцов РНК (от 1,7 до 2,0). Согласно спектрофотометрическим данным, в среднем для 30 свежих ооцитов концентрация общей РНК составляла 127,8 ± 9,3 нг мкл^–1 для MTP, 46,4 ± 9,5 нг мкл^–1 для CKP и 47,6 ± 12,9 нг мкл^–1 для GNTC. При использовании MTP для оценки РНК в 30 замороженных/оттаявших ооцитах концентрация общей РНК составила 61,3 ± 3,3 и 40,0 ± 12,4 нг мкл^–1 соответственно для DMSO и PROH. Что касается концентрации и чистоты общей РНК на стадии бластоцистов, большая чистота наблюдалась при использовании DMSO по сравнению с PROH (1,8 против 1,2) (p < 0,05). Лучшие результаты относительно амплификации генов также наблюдались в случае MTP по сравнению с другими протоколами. Для количественной оценки экспрессии генов предложенный протокол позволил определить экспрессию гена DNMT1 с эффективностью ПЦР (0,933) после нормализации в отношении экспрессии генов GAPDH и SDHA. Амплификация и количественная оценка экспрессии генов доказали специфичность и эффективность MTP в сравнении с другими протоколами.

Ключові слова: total RNA extraction, bovine oocytes and em-bryos, gene amplification and gene quantification

Цитологія і генетика 2015, том 49, № 4, C. 25-34

• University of the Azores, Department of Agrarian Sciences, CITA-A, Animal Reproduction, Angra do Heroísmo, Portugal
• Animal Production Department, Faculty of Agriculture, Cairo University, Giza, Egypt

E-mail: jsilva uac.pt

Pavani K.C., Baron E.E., Faheem M., Chaveiro A., Moreira Da Silva F. Optimisation of total RNA extraction from bovine oocytes and embryos for gene expression studies and effects of cryoprotectants on total RNA extraction, Цитологія і генетика., 2015, том 49, № 4, C. 25-34.

В "Cytology and Genetics". Якщо тільки можливо, цитуйте статтю по нашій англомовній версії:
K. C. Pavani, E. E. Baron, M. Faheem, A. Chaveiro, F. Moreira Da Silva Optimisation of total RNA extraction from bovine oocytes and embryos for gene expression studies and effects of cryoprotectants on total RNA extraction, Cytol Genet., 2015, vol. 49, no. 4, pp. 232–239
DOI: 10.3103/S0095452715040076