Промотори – це ключові елементи рівня експресії генів, тому їх вибір є важливим етапом в генно-інженерних дослідженнях. Репортерний ген gfp, що кодує зелений флуоресцентний білок (GFP), транзієнтно експресували в листкових тканинах махорки Nicotiana rusticа L. Порівняно з іншими видами роду Nicotiana вона має великий потенціал для експресії гетерологічних білків, велику вегетативну біомасу, легко інфільтрується, і при цьому, є невибагливою при вирощуванні. В роботі використовували шість створених нами генетичних конструкцій, які відрізнялися промоторними послідовностями: 35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти – Cauliflower Mosaic Virus (35S CaMV), подвійний 35S промотор (D35S CaMV), промотори генів RbcS1B та RbcS2B, що кодують малу субодиницю рибулозобісфосфаткарбоксилази (Rubisco), виділених з різушки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), та промотори генів LHB1B1 та LHB1B2 з A. thaliana, що кодують хлорофіл a-b зв’язуючі білки. Експресію гена gfp детектували на 7 день після інфільтрації візуально, спектрофлуориметрично та за білковим вмістом (метод Бредфорда). Найвищий рівень експресії спостері-гали при використанні подвійного 35S промотору (D35S CaMV), а найнижчий – при використанні промотору гена LHB1B1.
РЕЗЮМЕ. Промоторы – это ключевые элементы уровня экс-прессии генов, поэтому их выбор является важным этапом в генно-инженерных исследованиях. Репортерный ген gfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), транзиентно экспрессировали в листовых тканях махорки Nicotiana rustica L. По сравнению с другими видами рода Nicotiana она имеет большой потенциал для экспрессии гетерологичных белков, большую вегетативную биомассу, легко инфильтрируется, и при этом является неприхотливой при выращивании. В работе использовали шесть созданных нами генетических конструкций, которые отличались промоторными последовательностями: 35S промотор вируса мозаики цветной капусты – Cauliflower Mosaic Virus (35S CaMV), двойной 35S промотор (D35S CaMV), промоторы генов RbcS1B и RbcS2B, кодирующих малую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Rubisco), выделенных из резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), и промоторы генов LHB1B1 и LHB1B2 с A. thaliana, кодирующих хлорофилл a-b связывающие белки. Экспрессию гена gfp детектировали на 7 день после инфильтрации визуально, спектрофлуориметрично и по белковому содержанию (метод Брэдфорда). Самый высокий уровень экспрессии наблюдали при использовании двойного 35S промотора (D35S CaMV), а самый низкий –при использовании промотора гена LHB1B1.
Ключові слова: махорка, Nicotiana rusticа L., промотор, ген gfp, зелений флуоресцентний білок (GFP), транзієнта експресія, генетичні конструкції, спектро-флуориметрий аналіз, кількісний білковий аналіз
Повний текст та додаткові матеріали
Цитована література
1. Blazeck, J. and Alper, H., Systems metabolic engineering: genome-scale models and beyond, Biotechnol. J., 2010, vol. 5, no. 7, pp. 647–659. https://doi.org/10.1002/biot.200900247
2. Keasling, J.D., Manufacturing molecules through metabolic engineering, Science, 2010, vol. 330, no. 6009, pp. 1355–1358. https://doi.org/10.1126/science.1193990
3. Rosano, G.L. and Ceccarelli, E.A., Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges, Front. Microbiol., 2014, vol. 5, no. 172, pp. 1–17.https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172
4. De Vooght, L., Caljon, G., Stijlemans, B., De Baetselier, P., Coosemans, M., and Van Den Abbeele, J., Expression and extracellular release of a functional anti-trypanosome Nanobody® in Sodalis glossinidius, a bacterial symbiont of the tsetse fly, Microb. Cell Fact., 2012, vol. 1, no. 11, p. 1–11. doi. org/https://doi.org/10.1186/1475-2859-11-23
5. Sorensen, H.P. and Mortensen, K.K., Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli, J. Biotechnol., 2005, vol. 115, no. 2, pp. 113–128.https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2004.08.004
6. Orom, U.A., Nielsen, F.C., and Lund, A.H., MicroRNA-10a binds the 5’ UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation, Mol. Cell, 2008, vol. 30, no. 4, pp. 460–471. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2008.05.001
7. Wilkie, G.S., Dickson, K.S., and Gray, N.K., Regulation of mRNA translation by 5'- and 3'-UTR-binding factors, Trends Biochem. Sci., 2003, vol. 28, no. 4, pp. 182–188. https://doi.org/10.1016/S0968-0004(03)00051-3
8. Leppek, K., Das, R., and Barna, M., Functional 5’ UTR mRNA structures in eukaryotic translation regulation and how to find them, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2018, vol. 19, no. 3, pp. 158–174. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.103
9. Becker, J., Wittmann, C., Advanced biotechnology: Metabolically engineered cells for the bio-based production of chemicals and fuels, materials and healthcare products, Angew. Chem. Int. Ed., 2015, vol. 54, no. 11, pp. 3328–50. https://doi.org/10.1002/anie.201409033
10. Curran, K.A., Karim, A.S., Gupta, A., and Alper, H.S. Use of expression-enhancing terminators in Saccharomyces cerevisiae to increase mRNA half-life and improve gene expression control for metabolic engineering applications, Metab. Eng., 2013, vol. 19, pp. 88–97. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2013.07.001
11. Hernandez-Garcia, C.M. Finer, J.J., Identification and validation of promoters and cis-acting regulatory elements, Plant Sci., 2014, vol. 217, pp. 109–119.https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2013.12.007
12. Li, T., Liu, B., Spalding, M.H., Weeks, D.P., and Yang, B., High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice, Nat. Biotechnol., 2012, vol. 30, no. 5, p. 390–392. https://doi.org/10.1038/nbt.2199
13. Ndamukong, I., Abdallat, A.A., Thurow, C., Fode, B., Zander, M., Weigel, R., and Gatz, C., SA-inducible Arabidopsis glutaredoxin interacts with TGA factors and suppresses JA-responsive PDF1 2 transcription, Plant J., 2007, vol. 50, no. 1, pp. 128–139.https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03039.x
14. Kay, R., Chan, A.M.Y., Daly, M., and McPherson, J., Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes, Science, 1987, vol. 236, no. 4806, pp. 1299–1302. https://doi.org/10.1126/sci-ence.236.4806.1299
15. Izumi, M., Tsunoda, H., Suzuki, Y., Makino, A., and Ishida., H., RBCS1A and RBCS3B, two major members within the Arabidopsis RBCS multigene family, function to yield sufficient Rubisco content for leaf photosynthetic capacity, J. Exp. Bot., 2012, vol. 63, pp. 2159–70. https://doi.org/10.1093/jxb/err434
16. Blazeck, J., Alper, H.S., Promoter engineering: recent advances in controlling transcription at the most fundamental level, Biotechnol. J., 2013, vol. 8, no. 1, pp. 46–58. https://doi.org/10.1002/biot.201200120
17. Zhang, X.H., Webb, J., Huang, Y.H., Lin, L., Tang, R.S., and Liu, A., Hybrid Rubisco of tomato large subunits and tobacco small subunits is functional in tobacco plants, Plant Sci., 2011, vol. 180, no. 3, pp. 480–488. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2010.11.001
18. Umate, P., Genome-wide analysis of the family of light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins in Arabidopsis and rice, Plant Sign. Behav., 2010, vol. 5, no. 12, pp. 1537–1542.https://doi.org/10.4161/psb.5.12.13410
19. Varchenko, O.I., Krasyuk, B.M., Fedchunov, O.O., Zimina, O.V., Parii M.F., and Symonenko, Yu.V., Genetic constructs creating using Golden Gate method, Fact. Exp. Evol. Organ., 2019, vol. 25, pp. 190–196.https://doi.org/10.7124/FEEO.v25.1163
20. Bertani, G., Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli, J. Bacteriol., 1951, vol. 62, no. 3, pp. 293–300. PM-CID: PMC386127. PMID: 14888646. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC386127/.
21. Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado, J., Stahnke, J., Lai, H., Zhou, X., and Chen, Q., Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins, JoVE, 2013, vol. 77, pp. 1–9. e50521. https://doi.org/10.3791/50521
22. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. https://archive.org/details/in.ernet.dli.2015.474251/ page/n53/mode/2up
23. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 1976, vol. 72, pp. 248–254. https://doi.org/10.1006/abio.1976.9999
24. Ko, K. and Koprowski, H., Plant biopharming of monoclonal antibodies, Virus Res., 2005, vol. 111, no. 1, pp. 93–100. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2005.03.016
25. Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado, J., Stahnke, J., Lai, H., Zhou, X., and Chen, Q., Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins, JoVE, 2013, vol. 77, e50521. https://doi.org/10.3791/50521
26. Shamloul, M., Trusa, J., Mett, V., and Yusibov, V., Optimization and utilization of Agrobacterium-mediated transient protein production in Nicotiana, JoVE, 2014, vol. 86, e51204. https://doi.org/10.3791/51204
27. Conley, A.J., Zhu, H., Le, L.C., Jevnikar, A.M., Lee, B.H., Brandle, J.E., and Menassa, R., Recombinant protein production in a variety of Nicotiana hosts: a comparative analysis, Plant Biotechnol. J., 2011, vol. 9, no. 4, pp. 434–44. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2010.00563.x
28. Wally, O., Jayaraj, J., and Punja, Z.K., Comparative expression of β-glucuronidase with five different promoters in transgenic carrot (Daucus carota L.) root and leaf tissues, Plant Cell Rep., 2008, vol. 27, no. 2, pp. 279–287. https://doi.org/10.1007/s00299-007-0461-1
29. Anuar, M.R., Ismail, I., and Zainal, Z., Expression analysis of the 35S CaMV promoter and its derivatives in transgenic hairy root cultures of cucumber (Cucumis sativus) generated by Agrobacterium rhizogenes infection, Afr. J. Biotechnol., 2011, vol. 10, no. 42, pp. 8236–8244. https://doi.org/10.5897/AJB11.130
30. Patro, S., Kumar, D., Ranjan, R., Maiti, I.B., and Dey, N., The development of efficient plant promoters for transgene expression employing plant virus promoters, Mol. Plant, 2012, vol. 5, no. 4, pp. 941–944. https://doi.org/10.1093/mp/sss028
31. Li, Z., Jayasankar, S., and Gray, D.J., Expression of a bifunctional green fluorescent protein (GFP) fusion marker under the control of three constitutive promoters and enhanced derivatives in transgenic grape (Vitis vinifera), Plant Sci., 2001, vol. 160, no. 5, pp. 877–887. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(01)00336-3
32. Elliot, A.R, Campbell, J.A, Dugdale, B., Brettell, R.I.S., and Grof, C.P.L., Green-fluorescent protein facilitates rapid in vivo detection of genetically transformed plant cells, Plant Cell Rep., 1999, vol. 18, pp. 707–714. https://doi.org/10.1007/s002990050647
33. Blumenthal, A., Kuznetzova, L., Edelbaum, O., Raskin, V., Levy, M., and Sela, I., Measurement of green fluorescent protein in plants: quantification, correlation to expression, rapid screening and differential gene expression, Plant Sci., 1999, vol. 142, no. 1, pp. 93–99. https://doi.org/10.1016/S0168-9452(98)00249-0
34. Richards, H.A., Halfhill, M.D., Millwood, R.J., and Stewart, C.N.Jr., Quantitative GFP fluorescence as an indicator of recombinant protein synthesis in transgenic plants, Plant Cell Rep., 2003, vol. 22, no. 2, pp. 117–121. https://doi.org/10.1007/s00299-003-0638-1
35. Zhou, X., Carranco, R, Vitha, S., and Hall, T.C., The dark side of green fluorescent protein, New Phytol., 2005, vol. 168, no. 2, pp. 313–322. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2005.01489.x
36. Kapulnik, Y., Kahana, A., Bar-Akiva, A., Ben D.V.R., Wininger, S., and Ginzberg, I., US Patent no. 6844484, Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office, 2005.
37. Cui, X.Y., Chen, Z.Y., Wu, L., Liu, X.Q., Dong, Y.Y., Wang, F.W. and Li, H.Y. RbcS SRS4 promoter from Glycine max and its expression activity in transgenic tobacco, Genet. Mol. Res., 2015, vol. 14, no. 3, pp. 7395–7405. https://doi.org/10.4238/2015
38. Tanabe, N., Tamoi, M., and Shigeoka, S., The sweet potato RbcS gene (IbRbcS1) promoter confers high-level and green tissue-specific expression of the GUS reporter gene in transgenic Arabidopsis, Gene, 2015, vol. 567, no. 2, pp. 244–250.https://doi.org/10.1016/j.gene.2015.05.006
39. Kushwah, N.S., Isolation, cloning and characterization of promoter of rubisco small subunit 2B (rbc-S2B) gene of Arabidopsis thaliana, Innovat. Farm., 2016, vol. 1, no. 4, pp. 119–28. http://www.innovativefarming.in/ index.php/innofarm/article/view/150.
40. Dickinson, C.C., Weisberg, A.J., and Jelesko, J.G., Transient heterologous gene expression methods for poison ivy leaf and cotyledon tissues, Hort Sci., 2018, vol. 53, no. 2, pp. 242–246.https://doi.org/10.21273/HORTSCI12421-17