Проведено дослідження поліморфізму гену CHD, як модельного об’єкту для молекулярного сексування представників виду Bubo bubo (пугач звичайний). Проаналізовано методи класичної ПЛР для ампліфікації цільових фрагментів гену CHD з використанням маркерних систем P2/P8, 2550F/2718R та 1237L/1272H; рестрикційного (PCR-RFLP) і гетеродуплексного методичних підходів. Показано, що використання маркерної системи P2/P8 у рамках класичної ПЛР дає можливість ефективно проводити сексування птахів
тільки за умов електрофоретичного розподілу фрагментів у поліакриламідному гелі. При використанні маркерів 2550F/2718R й 1237L/1272H виявлено їх недостатню ефективність як в агарозному, так й у поліакриламідному гелях, внаслідок неможливості диференціювання генотипів CHDZZ та CHDZW. Доведено наявність поліморфного сайту рестрикції для HaeІІІ у ампліфікованих, за використання праймерів P2/P8, фрагментах CHDZ та CHDW. Для ендонуклеази рестрикції DdeІ поліморфного сайту не виявлено. Доведено високу ефективність використання гетеродуплексного аналізу на основі маркерів P2/P8 для сексування особин при електрофоретичному розподілі ампліфікованих фрагментів як у поліакриламідному, так і в агарозному гелях. У випадку експериментальних зразків, що містять амплікони CHDZ й CHDW, виявлено додаткові фрагменти гетеродуплексної ДНК, наявність яких дозволяє безпомилково визначити генотип птиці.
Ключові слова: Strigidae, Bubo bubo, поліморфізм, сексування, полімеразна ланцюгова реакція, рестрикція, гетеродуплекси
Повний текст та додаткові матеріали
Цитована література
1. Barros, T.B., Fraga, R.E., Ramos, C.N., and Tomazi, L., Improvement of the molecular sexing of parrots. in the State of Bahia, Acta Biol. Paran., 2017, vol. 46, nos. 3–4, pp. 89–107. https://doi.org/10.5380/abpr.v46i0.56731
2. Bermudez-Humaran, L.G., Chavez-Zamarripa, P., Guzman-Velasco, A., Leal-Garza, C.H., and Montes de Oca-Luna, R., Loss of restriction site DdeI, used for avian molecular sexing, in Oreophasis derbianus, Reprod. Domest. Anim., 2002a, vol. 37, pp. 321–323. https://doi.org/10.1046/j.1439-0531.2002.00362.x
3. Bermudez-Humaran, L.G., Garcia-Garcia, A., Leal-Garza, C.H., Riojas-Valdes, V.M., Jaramillo-Rangel, G., and Montes-de-Oca-Luna, R., Molecular sexing of monomorphic endangered Ara birds, J. Exp. Zool., 2002b, vol. 292, no. 7, pp. 77–80. https://doi.org/10.1002/jez.10070
4. Cakmak, E., Peksen, C.A., and Bilgin, C.C., Comparison of three different primer sets for sexing birds, J. Vet. Diagn. Invest., 2017, vol. 29, no. 1, pp. 59–63. https://doi.org/10.1177/1040638716675197
5. Casey, A.E., Jones, K.L., Sandercock, B.K., and Wisely, S.M., Heteroduplex molecules cause sexing errors in a standard molecular protocol for avian sexing, Mol. Ecol. Res., 2009, vol. 9, pp. 61–65. doi . 2008.02307.xhttps://doi.org/10.1111/j.1755-0998
6. Corters, O., Barroso, A., and Dunner, S., Avian sexing: an optimized protocol using polymerase chain reaction–single-strand conformation polymorphism, J. Vet. Diagn. Invest., 1999, vol. 11, pp. 297–299. 10.1177/10406387990110031
7. Delgado, M.D. and Penteriani, V., Gender determination of Eurasian Eagle-Owls (Bubo bubo) by morphology, J. Raptor Res., 2004, vol. 38, pp. 375–377.
8. Ellegren, H., First gene on the avian W chromosome (CHD) provides a tag for universal sexing of non-ratite birds, Proc. Biol. Sci., 1996, vol. 263, no. 1377, pp. 1635–1641. https://doi.org/10.1098/rspb.1996.0239
9. Fridolfsson, A. and Ellegren, H., A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds, J. Avian Biol., 1999, vol. 30, pp. 116–121. https://doi.org/10.2307/3677252
10. Garcia, C.B., Insausti, J.A., Gil, J.A., Frutos, A., Alcantara, M., Gonzalez, J., Cortes, M.R., Bonafonte, J.I., and Arruga, M.V., Comparison of different procedures of DNA analysis for sex identification in the endangered bearded vulture (Gypaetus barbatus), Eur. J. Wild Res., 2009, vol. 55, pp. 309–312. https://doi.org/10.1007/s10344-008-0239-y
11. Griffiths, R., Daan, S., and Dijkstra, C., Sex identification in birds using two CHD genes, Proc. R. Soc. London B, 1996, vol. 263, pp. 1251–1256. https://doi.org/10.1098/rspb.1996.0184
12. Griffiths, R., Double, M., Orr, K., and Dawson, R., A DNA test to sex most birds, Mol. Ecol., 1998, vol. 7, pp. 1071–1075. https://doi.org/10.1046/j.1365-294x.1998.00389.x
13. Griffiths, R. and Tiwari, B., Sex of the last wild Spix’s macaw, Nature, 1995, vol. 375, p. 454. https://doi.org/10.1038/375454a0
14. Insee, J., Kamolnorranath, S., Baicharoen, S., Chumpadang, S., Sawasu, W., and Wajjwalku, W., PCR-based method for sex identification of eastern sarus crane (Grus antigone sharpii): implications for reintroduction programs in Thailand, Zool. Sci., 2014, vol. 31, pp. 95–100. https://doi.org/10.2108/zsj.31.9
15. Kahn, N.W., John, J.S.T., and Quinn, T.W., Chromosome-specific intron size differences in the avian CHD gene provide an efficient method for sex identification in birds, Auk, 1998, vol. 115, no. 4, pp. 1074–1078. https://doi.org/10.2307/4089527
16. Krüger, O., The evolution of reversed sexual size dimorphism in hawks, falcons and owls: a comparative study, Evol. Ecol., 2005, vol. 19, no. 5, pp. 467–486. https://doi.org/10.1007/s10682-005-0293-9
17. Lee, M.Y., Hong, Y.J., Park, S.K., Kim, Y.J., Choi, T.Y., Lee, H., and Min, M.S., Application of two complementary molecular sexing methods for East Asian bird species, Genes Genom., 2008, vol. 30, no. 4, pp. 365–372.
18. Mario Leyn-Ortega, M., del Mar Delgado, M., Martinez, J.E., Penteriani, V., and Calvo, J.F., Factors affecting survival in Mediterranean populations of the Eurasian eagle owl, Eur. J. Wild Res., 2016, vol. 62, pp. 643–651. https://doi.org/10.1007/s10344-016-1036-7
19. Mataragka, A., Balaskas, C., Sotirakoglou, K., and Ikonomopoulos, J., Comparative evaluation of the performance of the PCR assays commonly used for the determination of sex in avian species, J. King Saud. Univ.–Sci., 2020, vol. 32, pp. 228–234. https://doi.org/10.1016/j.jksus.2018.04.020
20. Medeiros, R.T., Chaves, F.G., Vecchi, M.B., Nogueira, D.M., and Alves, M.A.S., Molecular sexing and inter-sexual differences in the morphometry of the Hang-nest tody-tyrant Hemitriccus nidipendulus (Passeriformes: Rhynchocyclidae), Zoologia, 2019. https://doi.org/10.3897/zoologia.36.e32771
21. Miyaki, C.Y., Sex identification of parrots, toucans, and curassows by PCR: perspectives for wild and captive population studies, Zoo Biol., 1998, vol. 17, pp. 415–423. https://doi.org/10.1002/(SICI)1098-2361(1998)17:5<415::AID-ZOO6>3.0.CO;2-2
22. Patino, L., Cruz, M., Martinez, P., and Cedeno-Escobar, V., Using PCR-RFLP for sexing of the endangered Galapagos petrel (Pterodroma phaeopygia), Genet. Mol. Res., 2013, vol. 12, no. 2, pp. 4760–4767. https://doi.org/10.4238/2013.October.18.13
23. Penteriani, V., Alonso-Alvarez, C., del Mar Delgado, M., Sergio, F., and Ferrer, M., Brightness variability in the white badge of the eagle owl Bubo bubo, J. Avian Biol., 2006, vol. 37, no. 1, pp. 110–116. https://doi.org/10.1111/j.0908-8857.2006.03569.x
24. Ravindran, S., Saufi, S., Amni, W.N., Ishak, I., Hamid, N.H., Abidin, C.M.R.Z., Ahmad, A.H., Azzam, G., and Salim, H., Sex identification comparison of barn owls (Tyto alba javanica) using morphological features and molecular-based methods, Slovak Raptor J., 2018, vol. 12, pp. 47–54.https://doi.org/10.2478/srj-2018-0005
25. Ravindran, S., Woo, W.K., Saufi, S., Amni, W.N., Hamid, N.H., Abidin, C.M.R.Z., Ishak, I., Azzam, G., and Salim, H., Molecular sexing of Southeast Asian barn owl, Tyto alba javanica, using blood and feather, Trop. Life Sci. Res., 2019, vol. 30, no. 2, pp. 13–23. https://doi.org/10.21315/tlsr2019.30.2.2
26. Sacchi, P., Soglia, D., Maione, S., Meneguz, G., Campora, M., and Rasero, R., A non-invasive test for sex identification in short-toed Eagle (Circa etus gallicus), Mol. Cell Prob., 2004, vol. 18, no. 3, pp. 193–196. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2004.01.002
27. Seidensticker, M.T., Holt, D.W., Detienne, J., Talbot, S., and Gray, K., Sexing young snowy owls, J. Raptor Res., 2011, vol. 45, no. 4, pp. 281–289. https://doi.org/10.3356/JRR-11-02.1
28. Tornberg, R., Mikkola, H., and Rytkönen, S., Morphometric sex determination of Great Grey Owls Strix nebulosa, Ornis Norvegica, 2016, vol. 39, pp. 6–10. https://doi.org/10.15845/on.v39i0.991
29. Valadan, R., Nejatollahi, F., Ehsaninori, H., Habibi, H., Amini, H., and Aliabadian, M., Avian gametologs as molecular tags for sex identification in birds of prey of Iran, Zoo Biol., 2017, vol. 36, no. 8, pp. 289–293. https://doi.org/10.1002/zoo.21363
30. Vucicevic, M., Stevanov-Pavlovic, M., Stevanovic, J., Bosnjak, J., Gajic, B., Aleksic, N., and Stanimirovic, Z., Sex determination in 58 bird species and evaluation of CHD gene as a universal molecular marker in bird sexing, Zoo Biol., 2013, vol. 32, pp. 269–276. https://doi.org/10.1002/zoo.21010
31. Wang, L.C., Severinghaus, L.L., Chen, C.T., Liu, L.Y., Pan, C.H., Huang, D., Lee, H.Y., Lir, J.T., Chin, S.C., and Pu, C.E., Sex identification of owls (family Strigidae) using oligonucleotide microarrays, J. Hered., 2008, vol. 99, no. 2, pp. 187–192. doi.org/https://doi.org/10.1093/jhered/esm107
32. Wang, P.H., Hsu, H.A., Chao, M.C., Chan, F.T., Wang, L.M., Lin, P.I., Tsao, H.S., Yuan, H.W., Chen, C.C., and Ding, S.T., Sex identification in the Collared Scops Owl (Otus bakkamoena) with novel markers generated by random amplified polymorphic DNA, Conserv. Genet Res., 2013, vol. 5, pp. 239–242. https://doi.org/10.1007/s12686-012-9778-3