РЕЗЮМЕ. Протеинкиназы SnRK1 являются неотъемлемой составляющей клеточного сигналинга, причастные к ответу на стрессы, регуляции энергетического обмена, прорастание и созревания семян, аутофа-ии и т.д. Тем не менее, многие функции этих протеинкиназ остаются неизвестными. С целью изучения внутриклеточной локализации KIN10 (каталитической субъединицы протеинкиназних комплексов SnRK1) было проведено трансформацию протопластов дикого екотипу A. thaliana (Col-0) конструкцией, содержащей химерный ген KIN10-RFP, и установлено, что химерный белок KIN10-RFP диффузно распределяется в цитоплазме, однако при этом преимущественно локализуется на периферии, в примембранной области, клеток. С помощью иммунофлюоресцентной микроскопии было продемонстрировано диффузную локализацию KIN10, а также γ-тубулина в цитоплазме клеток корней A. thaliana. Установлены различия в внутриклеточной локализации γ-тубулина в клетках корней нокаутных мутантов kin10, kin11 и дикого типа A. thaliana. В обоих мутантов наблюдали низкую интенсивность флуоресценции γ-тубулина по сравнению с диким типом, что может свидетельствовать о определенные нарушения в формировании их γ-тубулиновых комплексов. Низкую интенсивность флуоресценции γ-тубулина также было зафиксировано в клетках всех исследуемых линий, выращенных в условиях энергетического дефицита. В частности, самый низкий уровень флуоресценции за действия такого стресса фик-сировали в мутантах kin10 и kin11, что может свидетельствовать о влиянии синергического эффекта одновременной дисфункции одного из этих генов и энергетического дефицита на формирование комплексов γ-тубулина (γTuSC и γTuRC). Полученные результаты демонстрируют возможно участие SnRK1 (KIN10 и KIN11) в физиологической ответе растений на энергетический стресс. Учитывая также полученные нами данные относительно возможного фосфорилирования KIN10 растительного γ-тубулина по остатку Ser131, можно предположить участие протеинкиназы SnRK1 в регуляции полимеризации микротрубочек у растений.
Протеїнкінази SnRK1 є невід’ємною складовою клітинного сигналінгу, причетні до відповіді на стреси, регуляції енергетичного обміну, проростання та дозрівання насіння, аутофагії і т.д. Тим не менше, багато функцій цих протеїнкіназ залишаються невідомими. З метою вивчення внутрішньоклітинної локалізації KIN10 (каталітичної субодиниці протеїнкіназних комплексів SnRK1) було проведено трансформацію протопластів дикого екотипу A. thaliana (Col-0) конструкцією, що містила химерний ген KIN10-RFP, та встановлено, що химерний білок KIN10-RFP дифузно розподіляється в цитоплазмі, однак при цьому переважно локалізується на периферії, в примембранній області, клітин. За допомогою імунофлюоресцентної мікроскопії було продемонстровано дифузну локалізацію KIN10, а також γ-тубуліну в цитоплазмі клітин коренів A. thaliana. Встановлено відмінності у внутрішньоклітинній локалізації γ-тубуліну в клітинах коренів нокаутних мутантів kin10, kin11 та дикого типу A. thaliana. У обох мутантів спостерігали нижчу інтенсивність флуоресценції γ-тубуліну в порівнянні з диким типом, що може свідчити про певні порушення у формуванні їх γ-тубулінових комплексів. Нижчу інтенсивність флуоресценції γ-тубуліну також було зафіксовано в клітинах всіх досліджуваних ліній, вирощених за умов енергетичного дефіциту. Зокрема, найнижчий рівень флуоресценції за дії такого стресу фіксували в мутантах kin10 та kin11, що може свідчити про вплив синергічного ефекту одночасної дисфункції одного з цих генів та енергетичного дефіциту на формування комплексів γ-тубуліну (γTuSC та γTuRC). Отримані результати демонструють можливе залучення SnRK1 (KIN10 та KIN11) до фізіологічної відповіді рослин на дію енергетичного стресу. Враховуючи також отримані нами дані стосовно можливого фосфорилювання KIN10 рослинного γ-тубуліну за залишком Ser131, можна припустити участь протеїнкіназ SnRK1 в регуляції полімеризації мікротрубочок у рослин.
Ключові слова: SnRK1, протеинкиназы, γ-тубулин, клеточная локализация, KIN10, KIN11, мутантные линии
SnRK1, протеїнкінази, γ-тубулін, клітинна локалізація, KIN10, KIN11, мутантні лінії
Повний текст та додаткові матеріали
У вільному доступі: PDFЦитована література
1. Polge, C. and Thomas, M., SNF1/AMPK/SnRK1 kinases, global regulators at the heart of energy control?, Trends Plant Sci., 2007, vol. 21, no. 1, pp. 20–28. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2006.11.005
2. Lumbreras, V., Alba, M.M., Kleinow, T., Koncz, C., and Pages, M., Domain fusion between SNF1-related kinase subunits during plant evolution, EMBO Rep., 2001, vol. 2, no. 1, pp. 55–60. https://doi.org/10.1093/emboreports/kve001
3. Cho, H.Y., Wen, T.N., Wang, Y.T., and Shih, M.C., Quantitative phosphoproteomics of protein kinase SnRK1 regulated protein phosphorylation in Arabidopsis under submergence, J. Exp. Bot., 2016, vol. 67, no. 9, pp. 2745–2760. https://doi.org/10.1093/jxb/erw107
4. Crozet, P., Margalha, L., Confraria, A., Rodrigues, A., Martinho, C., Adamo, M., Elias, C.A., and Baena-González, E., Mechanisms of regulation of SNF1/AMPK/SnRK1 protein kinases, Front. Plant Sci., 2014, no. 5. https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00190
5. Hardie, D.G., AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2007, vol. 8, no. 10, pp. 774–785. https://doi.org/10.1038/nrm2249
6. Broeckx, T., Hulsmans, S., and Rolland, F., The plant energy sensor: evolutionary conservation and divergence of SnRK1 structure, regulation, and function, J. Exp Bot., 2016, vol. 67, no. 22, pp. 6215–6252. https://doi.org/10.1093/jxb/erw416
7. Baena-González, E., Rolland, F., Thevelein, J.M., and Sheen, J., A central integrator of transcription networks in plant stress and energy signalling, Nature, 2007, vol. 448, no. 7156, pp. 938–942. https://doi.org/10.1038/nature06069
8. Zhang, Y., Primavesi, L.F., Jhurreea, D., Andralojc, P.J., Mitchell, R.A., Powers, S.J., Schluepmann, H., Delatte, T., Wingler, A., and Paul, M.J., Inhibition of SNF1-related protein kinase1 activity and regulation of metabolic pathways by trehalose-6-phosphate, Plant Physiol., 2009, vol. 149, no. 4, pp. 1860–1871. https://doi.org/10.1104/pp.108.133934
9. Nagele, T. and Weckwerth, W., Mathematical modeling reveals that metabolic feedback regulation of SnRK1 and hexokinase is sufficient to control sugar homeostasis from energy depletion to full recovery, Front. Plant Sci., 2014, vol. 5, no. 365, https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00365
10. Nunes, C., O’Hara, L.E., Primavesi, L.F., Delatte, T.L., Schluepmann, H., Somsen, G.W., Silva, A.B., Fevereiro, P.S., Wingler, A., and Paul, M.J., The trehalose 6-phosphate/SnRK1 signaling pathway primes growth recovery following relief of sink limitation, Plant Physiol., 2013, vol. 162, no. 3, pp. 1720–1732. https://doi.org/10.1104/pp.113.220657
11. Mair, A., Pedrotti, L., Wurzinger, B., Anrather, D., Simeunovic, A., Weiste, C., Valerio, C., Dietrich, K., Kirchler, T., Nägele, T., Carbajosa, J.V., Hanson, J., Baena-González, E., Chaban, C., Weckwerth, W., Dröge-Laser, W., and Teige, M., SnRK1-triggered switch of bZIP63 dimerization mediates the lowenergy response in plants, eLife, 2015. https://doi.org/10.7554/eLife.05828
12. Nukarinen, E., Nägele, T., Pedrotti, L., Wurzinger, B., Mair, A., Landgraf, R., Börnke, F., Hanson, J., Teige, M., Baena-González, E., Dröge-Laser, W., and Weckwerth, W., Quantitative phosphoproteomics reveals the role of the AMPK plant ortholog SnRK1 as a metabolic master regulator under energy deprivation, Sci. Rep., 2016, vol. 6. https://doi.org/10.1038/13.srep31697
13. Soto-Burgos, J. and Bassham, D.C., SnRK1 activates autophagy via the TOR signaling pathway in Arabidopsis thaliana, PLoS One, 2017, vol. 12, no. 8, e0182591. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182591
14. Krasnoperova, E.E., Buy, D.D., Goriunova, I.I., Isayenkov, S.V., Karpov, P.A., Blume, Ya.B., and Yemets, A.I., Potential role of protein kinases SNRK1 in regulation of cell division of Arabidopsis thaliana, Cytol. Genet., 2019. vol. 53, no. 3 (in press).
15. Krasnoperova, E.E., Isayenkov, S.V., Karpov, P.A., and Yemets, A.I., The cladistic analysis and characteristic of an expression of serine/threonine protein kinase KIN10 in different organs of Arabidopsis thaliana, Rep. Natl. Acad. Sci. Ukraine, 2016, no. 1, pp. 81–91. https://doi.org/10.15407/dopovidi2016.01.081
16. Karpov, P.A., Rayevsky, A.V., Krasnoperova, E.E., Isayenkov, S.V., Yemets, A.I., and Blume, Ya.B., Protein kinase KIN10 from Arabidopsis thaliana as a potential regulator of primary microtubule nucleation centers in plants, Cytol. Genet., 2017, vol. 51, no. 6, pp. 415–421. https://doi.org/10.3103/S0095452717060056
17. Mohannath, G., Jackel, J.N., Lee, Y.H., Buchmann, R.C., Wang, H., Patil, V., Adams, A.K., and Bisaro, D.M., A complex containing SNF1-related kinase (SnRK1) and adenosine kinase in Arabidopsis, PLoS One, 2014, vol. 149, no. 4, e87592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087592
18. Jossier, M., Bouly, J.P., Meimoun, P., Arjmand, A., Lessard, P., Hawley, S., Grahame, HardieD., and Thomas, M., SnRK1 (SNF1-related kinase 1) has a central role in sugar and ABA signalling in Arabidopsis thaliana, Plant J., 2009, vol. 59, no. 2, pp. 316–328. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2009.03871.x
19. Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen, J., Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis, Nat. Protoc., 2007, vol. 2, no. 7, pp. 1565–1572. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.199
20. Krasnoperova, E.E., Novozhylov, D.O., Blume, Y.B., and Isayenkov, S.V., Creating of the plasmid construction protein kinase AtKIN10, conjoint with RFP to study the cellular localization of this enzyme, Proc. Uman NUH, 2014, vol. 84, no. 1, pp. 95–100. http://nbuv.gov.ua/UJRN/zhpumus_2014_84_15.
21. Isayenkov, S.V., Isner, J.C., and Maathuis, F.J., Rice two-pore K+ channels are expressed in different types of vacuoles, Plant Cell, 2011, vol. 23, no. 2, pp. 756–768. https://doi.org/10.1105/tpc.110.081463
22. Szechyńska-Hebda, M., Wedzony, M., Dubas, E., Kieft, H., and van Lammeren, A., Visualisation of microtubules and actin filaments in fixed BY-2 suspension cells using an optimised whole mount immunolabelling protocol, Plant Cell Rep., 2006, vol. 25, no. 8, pp. 758–766. https://doi.org/10.1007/s00299-005-0089-y
23. Sheen, J., Master regulators in plant glucose signaling network, J. Plant Biol., 2014, vol. 57, no. 2, pp. 67–79. https://doi.org/10.1007/s12374-014-0902-7
24. Fragoso, S., Espíndola, L., Páez-Valencia, J., Gamboa, A., Camacho, Y., Martínez-Barajas, E., and Coello, P., SnRK1 isoforms AKIN10 and AKIN11 are differentially regulated in Arabidopsis plants under phosphate starvation, Plant Physiol., 2009, vol. 149, no. 4, pp. 1906–1916. https://doi.org/10.1104/pp.108.133298
25. Hulsmans, S., Rodriguez, M., De Coninck, B., and Rolland, F., The SnRK1 energy sensor in plant biotic interactions, Trends Plant Sci., 2016, vol. 21, no. 8, pp. 648–661. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2016.04.008
26. Eklund, G., Lang, S., Glindre, J., Ehlén, A., and Alvarado-Kristensson, M., The nuclear localization of -tubulin is regulated by SadB-mediated phosphorylation, J. Biol. Chem., 2014, vol. 289, no. 31, pp. 21360–21373. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.562389
27. Sample, V., Ramamurthy, S., Gorshkov, K., Ronnett, G.V., and Zhang, J., Polarized activities of AMPK and BRSK in primary hippocampal neurons, Mol. Biol. Cell, 2015, vol. 26, no. 10, pp. 1935–1946. https://doi.org/10.1091/mbc.E14-02-0764
28. Alvarado-Kristensson, M., Rodríguez, M.J., Silio, V., Valpuesta, J.M., and Carrera, A.C., SADB phosphorylation of γ-tubulin regulates centrosome duplication, Nat. Cell Biol., 2009, vol. 11, pp. 1081–1092. https://doi.org/10.1038/ncb1921
29. Dhumale, P., Menon, S., Chiang, J., and Puschel, A.W., The loss of the kinases SadA and SadB results in early neuronal apoptosis and a reduced number of progenitors, PLoS One, 2018, vol. 13, no. 4. e0196698. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196698
30. Eklund, G., Lang, S., Glindre, J., Ehlen, A., and Alvarado-Kristensson, M., The nuclear localization of γ-tubulin is regulated by SadB-mediated phosphorylation, J. Biol. Chem., 2014, vol. 289, no. 31, pp. 21360–21373. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.562389
31. Kollman, J.M., Merdes, A., Mourey, L., and Agard, D.A., Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2011, vol. 12, pp. 709–721. https://doi.org/10.1038/nrm3209
32. Yemets, A., Stelmakh, O., and Blume, Y.B., Effects of the herbicide isopropyl-N-phenyl carbamate on microtubules and MTOCs in lines of Nicotiana sylvestris resistant and sensitive to its action, Cell Biol Int., 2008, vol. 32, no. 6, pp. 623–629. https://doi.org/10.1016/j.cellbi.2008.01.012