РЕЗЮМЕ. Сателітна ДНК – це головний компонент функціональних центромер, який утворює основну структурну складову гетерохроматину. Присутність лужно-лабільних сайтів (ЛЛС) – це властивість, притаманна структурі хроматину. Метою цієї роботи було охарактеризувати ЛЛС у різних локусах сателітних ДНК у цервікальних епітеліальних клітинах, використовуючи виявлення розривів ДНК у поєднанні з флуоресцентною гібридизацією in situ (DBD–FISH). Цервікальні епітеліальні клітини, вставлені в агарозну матрицю, були звільнені від білків і піддані впливу лужної денатурації, після чого були сформовані однониткові ДНК (ssДНК), починаючи з кінців спонтанних розривів основних ДНК та ЛЛС. Кількість ssДНК, утворених в межах певної ділянки послідовності, визначали за методом DBD–FISH з використанням певних зондів. Сигнали DBD–FISH, скореговані щодо відповідних сигналів FISH під час метафази, були значно сильнішими у проаналізованих класичних доменах сателітних ДНК на 5 п.н. (D1Z1, D9Z3 та D16Z3) порівняно з альфа сателітними регіонами (D3Z1, D8Z2 та DXZ1). Лужна денатурація найбільше вплинула на D1Z1 локус хромосоми-1, і навпаки, локус D3Z1 хромосоми–3 був найменш чутливим до впливу лужного середовища. Ці результати демонструють високу щільність конститутивних ЛЛС – можливих AP-сайтів – у межах послідовностей сателітних ДНК на 5 п.н. у цервікальних епітеліальних клітинах. Присутність та відносна розповсюдженість ЛЛС може бути поясненням високої частотності спонтанних розривів та перебудов у перицентромерному гетерохроматині хромосом 1, 9 і 16, коли відбувається спонтанне або індуковане блокування конденсації цієї ділянки хроматину, подібно до наслідків вірусної інфекції. ЛЛС у таких послідовностях можуть бути корисним інструментом моніторингу пошкоджень ДНК у випадку цервікального канцерогенезу.
Ключові слова: лужно-лабільні сайти; ЛЛС; виявлення розривів ДНК; DBD–FISH, цервікальний епітелій
Повний текст та додаткові матеріали
Цитована література
1. Tyler-Smith, C. and Willard, H.F., Mammalian chromosome structure, Curr. Opin. Genet. Dev., 1993, vol. 3, no. 3, pp. 390–397. https://doi.org/10.1016/0959-437x(93)90110-b
2. Meyne, J., Goodwin, E.H., and Moyzis, R.K., Chromosome localization and orientation of the simple sequence repeat of human satellite I DNA, Chromosoma, 1994, vol. 103, no. 2, pp. 99–103. https://doi.org/10.1007/bf00352318
3. Albright, K.L., Bartholdi, M.F., Cram, L.S., Deaven, L.L., Hildebrand, C.E., Joste, E.N., Longmire, J.L., Meyne, J., and Schwarzacher-Robinson, T., Human chromosome-specific repetitive DNA sequences: novel markers for genetic analysis, Chromosoma, 1987, vol. 95, no. 6, pp. 375–386. https://doi.org/10.1007/bf00333988
4. Jeanpierre, M., Human satellite 2 and 3, Ann. Génét., 1994, vol. 37, no. 4, pp. 163–171.
5. Aze, A., Sannino, V., Soffientini, P., Bachi, A., and Costanzo, V., Centromeric DNA replication reconstitution reveals DNA loops and ATR checkpoint suppression, Nat. Cell Biol., 2016, vol. 18, no. 6, pp. 8684–8691. https://doi.org/10.1038/ncb3344
6. Fernández, J.L., Goyanes, V., Ramiro-Diaz, J., and Gosálvez, J., Application of FISH for in situ detection and quantification of DNA breaks, Cytogenet. Cell Genet., 1998, vol. 82, nos 3-4, pp. 251–256. https://doi.org/10.1159/000015112
7. Cortés-Gutiérrez, E.I., Dávila-Rodríguez, M.I., Fernandez, J.L., López-Fernández, C., and Gosálvez, J., DNA damage in women with cervical neoplasia evaluated by DNA breakage detection-fluorescence in situ hybridization, Anal. Quant. Cytol. Histol., 2011, vol. 33, no. 3, pp. 175–181.
8. Vogt, P., Code domains in tandem repetitive DNA sequence structures, Chromosoma, 1992, vol. 101, no. 10, pp. 585–589. https://doi.org/10.1007/bf00360534
9. Fernández, J.L., Valverde, D., Goyanes, V., Buño, I., and Gosálvez, J., Alu I in situ digestion of human alphoid and classical satellite DNA regions: high-resolution digital image analysis of FISH signals from condensed and extended chromatin, Cytogenet. Cell Genet., 1997, vol. 76, nos. 1–2, pp. 94–100. https://doi.org/10.1159/000134522
10. Gosálvez, J., López-Fernández, C., Goyanes, V., and Mezzanotte, R., Chromosome differentiation using nucleases: an overview, in Chromosomes Today, Henriques-Gil, N., Parker, J.S., and Puertas, M.J., Eds., London: Chapman and Hall, 1997, vol. 12, pp. 23–49. https://doi.org/10.1007/978-94-009-1537-4_2
11. Darzynkiewicz, Z., Huang, X., and Okafuji, M., Detection of DNA strand breaks by flow and laser scanning cytometry in studies of apoptosis and cell proliferation (DNA replication), Methods Mol. Biol., 2006, vol. 314, pp. 81–93. https://doi.org/10.1385/1-59259-973-7:081
12. Gore, J., Bryant, Z., Nollmann, M., Le, M.U., Cozzarelli, N.R., and Bustamante, C., DNA overwinds when stretched, Nature, 2006, vol. 442, no. 7104, pp. 836–839. https://doi.org/10.1038/nature04974
13. Fernández, J.L., Vázquez-Gundín, F., Rivero, M.T., Genescá, A., Gosálvez, J., and Goyanes, V., DBD-FISH on neutral comets: simultaneous analysis of DNA single- and double-strand breaks in individual cells, Exp. Cell Res., 2001, vol. 270, no. 1, pp. 102–109. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-409-8_11
14. Cortés-Gutiérrez, E.I., Ortíz-Hernández, B.L., Dávila-Rodríguez, M.I., Cerda-Flores, R.M., Fernández, J.L., López-Fernández, C., and Gosálvez, J., 5-bp Classical satellite DNA loci from chromosome-1 instability in cervical neoplasia detected by DNA breakage detection/fluorescence in situ hybridization (DBD-FISH), Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 2, pp. 4135–4147. https://doi.org/10.3390/ijms14024135
15. Cortés-Gutiérrez, E.I., Dávila-Rodríguez, M.I., Fernández, J.L., López-Fernández, C., and Gosálvez, J., Koilocytes are enriched for alkaline-labile sites, Eur. J. Histochem., 2010, vol. 54, no. 4. e32. https://doi.org/10.4081/ejh.2010.e32
16. Fernández, J.L., Vazquez-Gundin, F., Rivero, M.T., Goyanes, V., and Gosálvez, J., Evidence of abundant constitutive alkali-labile sites in human 5 bp classical satellite DNA loci by DBD-FISH, Mutat. Res., 2001, vol. 473, no. 2, pp. 163–168. https://doi.org/10.1016/s0027-5107(00)00146-9
17. Cortés-Gutiérrez, E.I., Dávila-Rodríguez, M.I., López-Fernández, C., Fernández, J.L., and Gosálvez, J., Alkali-labile sites in sperm cells from Sus and Ovis species, Int. J. Androl., 2008, vol. 31, no. 3, pp. 354–363. https://doi.org/10.1111/j.1365-2605.2007.00781.x
18. Vazquez-Gundin, F., Goyanes, V., Campos, A., Blasco, M., Gosálvez, J., and Fernández, J.L., High frequency of constitutive alkali-labile sites in mouse major satellite DNA, detected by DNA breakage detection-fluorescence in situ hybridization, Mutat. Res., 2001, vol. 483, nos. 1–2, pp. 43–50. https://doi.org/10.1016/s0027-5107(01)00218-4
19. Rivero, M.T., Mosquera, A., Goyanes, V., Slijepcevic, P., and Fernández, J.L., Differences in repair profiles of interstitial telomeric sites between normal and DNA double-strand ALS in mammalian sperm break repair deficient Chinese hamster cells, Exp. Cell Res., 2004, vol. 295, no. 1, pp. 161–172. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2003.12.031
20. López-Fernández, C., Arroyo, F., Fernández, J.L., and Gosálvez, J., Interstitial telomeric sequence blocks in constitutive pericentromeric heterochromatin from Pyrgomorpha conica (Orthoptera) are enriched in constitutive alkali-labile sites, Mutat. Res., 2006, vol. 599, nos. 1–2, pp. 36–44. https://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2006.01.004
21. Cortés-Gutiérrez, E.I., López-Fernández, C., Fernández, J.L., Dávila-Rodríguez, M.I., Johnston, S.D., and Gosálvez, J., Interpreting sperm DNA damage in a diverse range of mammalian sperm by means of the two-tailed comet assay, Front. Genet., 2014, vol. 27, no. 5, p. 404. https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00404
22. Von Sonntag, C., Carbohydrate radicals: from ethylene glycol to DNA strand breakage, Int. J. Radiat. Biol., 2014, vol. 90, no. 6, pp. 416–422. https://doi.org/10.3109/09553002.2014.908040
23. Bandyopadhyay, R., Berend, S.A., Page, S.L., Choo, K.H., and Shaffer, L.G., Satellite III sequences on 14p and their relevance to Robertsonian translocation formation, Chromosome Res., 2001, vol. 9, no. 3, pp. 235–242. https://doi.org/10.1023/a:1016652621226
24. Lana, E., Megarbane, A., Tourriere, H., Sarda, P., Lefranc, G., Claustres, M., and De Sario, A., DNA replication is altered in Immunodeficiency Centromeric instability Facial anomalies (ICF) cells carrying DNMT3B mutations, Eur. J. Hum. Genet., 2012, vol. 20, no. 1, pp. 1044–1050. https://doi.org/10.1038/ejhg.2012.41
25. Jefferson, A., Colella, S., Moralli, D., Wilson, N., Yusuf, M., Gimelli, G., Ragoussis, J., and Volpi, E.V., Altered intra-nuclear organisation of heterochromatin and genes in ICF syndrome, PLoS One, 2010, vol. 5, no. 6. e11 364. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011364
26. Toubiana, S., Velasco, G., Chityat, A., Kaindl, A.M., Hershtig, N., Tzur-Gilat, A., and Francastel, C., Subtelomeric methylation distinguishes between subtypes of Immunodeficiency. Centromeric Instability and Facial Anomalies (ICF) syndrome, Hum. Mol. Genet., 2018, vol. 27, no. 20, pp. 3568–3581. https://doi.org/10.1093/hmg/ddy265